保健品抗氧化功能檢測(cè)

2025年1月，《保健食品原料保健功能聲稱科學(xué)證據(jù)評(píng)價(jià)技術(shù)指南》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)在北京正式發(fā)布，其中抗氧化功能評(píng)價(jià)被列為重點(diǎn)修訂項(xiàng)目。這一標(biāo)準(zhǔn)的更新，標(biāo)志著我國(guó)保健品抗氧化功能檢測(cè)進(jìn)入"多方法驗(yàn)證+臨床循證"的新階段。目前，權(quán)wei檢測(cè)機(jī)構(gòu)已建立起涵蓋化學(xué)體外檢測(cè)、細(xì)胞模型驗(yàn)證和人體試食試驗(yàn)的三級(jí)評(píng)價(jià)體系，其中ORAC(氧自由基吸收能力)、DPPH/ABTS自由基清除率、FRAP鐵還原能力及脂質(zhì)過氧化抑制率測(cè)定構(gòu)成了核心技術(shù)矩陣。

化學(xué)體外檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化流程

ORAC氧自由基吸收能力測(cè)定作為國(guó)ji公ren的黃金標(biāo)準(zhǔn)，采用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)520nm)追蹤熒光素探針的衰減曲線，以Trolox當(dāng)量(μmol TE/g)量化樣品清除過氧自由基的能力。北京中科光析科學(xué)技術(shù)研究所采用的AOAC Official Method 2012.04標(biāo)準(zhǔn)流程，要求反應(yīng)體系溫度控制在37±0.1℃，通過恒溫振蕩反應(yīng)池實(shí)現(xiàn)自由基生成速率的穩(wěn)定性控制。該方法能模擬生物體內(nèi)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程，檢測(cè)范圍覆蓋0~20000μmol TE/g，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤3%。

DPPH與ABTS自由基清除率測(cè)定作為快速篩查手段，分別在517nm和734nm波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)吸光度變化。其中DPPH法操作簡(jiǎn)便，30分鐘即可完成檢測(cè)，但易受樣品色素干擾;ABTS法則適用于水溶性和脂溶性抗氧化劑的聯(lián)合評(píng)價(jià)，反應(yīng)時(shí)間縮短至6分鐘。北檢院數(shù)據(jù)顯示，優(yōu)質(zhì)葡萄籽提取物的DPPH自由基清除率IC50值通?！?.5mg/mL，而綠茶提取物的ABTS TEAC值可達(dá)2.0mmol/g以上。

FRAP鐵還原抗氧化能力測(cè)定通過監(jiān)測(cè)593nm處Fe2?-TPTZ絡(luò)合物的藍(lán)色生成量，評(píng)估樣品的電子捐贈(zèng)能力。該方法在pH 3.6的酸性條件下進(jìn)行，反應(yīng)溫度37℃，檢測(cè)范圍0~10000μmol Fe2?/g。值得注意的是，F(xiàn)RAP法僅能反映還原性抗氧化成分，需與其他方法聯(lián)合使用才能全面評(píng)價(jià)抗氧化體系。

關(guān)鍵儀器操作與質(zhì)量控制

熒光分光光度計(jì)(如島津RF-6000)在ORAC測(cè)定中需每日進(jìn)行激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)校準(zhǔn)，確保激發(fā)波長(zhǎng)485nm±2nm、發(fā)射波長(zhǎng)520nm±2nm的精度控制。自動(dòng)移液工作站(精度0.1μL)用于實(shí)現(xiàn)微量樣品及試劑的高通量精準(zhǔn)加樣，避免人為操作誤差。

紫外可見分光光度計(jì)(如島津UV-2600)在DPPH/ABTS測(cè)定前需進(jìn)行基線校正，狹縫寬度設(shè)置為2nm，掃描速度300nm/min。對(duì)于深色樣品，應(yīng)采用校正公式消除背景干擾：樣品實(shí)際清除率=(A0-As)/A0×100%-(A0'-As')/A0'×100%，其中A0'和As'分別為空白溶劑的初始和反應(yīng)后吸光度。

恒溫振蕩反應(yīng)池需維持±0.1℃的溫度波動(dòng)控制，確保過氧自由基生成速率的穩(wěn)定性。在脂質(zhì)過氧化抑制率測(cè)定中，采用硫代巴bi妥酸反應(yīng)物(TBARS)法，通過532nm處吸光度變化評(píng)估丙二醛(MDA)生成量，抑制率≥80%為優(yōu)異指標(biāo)。

抗氧化成分的定量分析體系

多酚類物質(zhì)檢測(cè)依據(jù)GB 5009.268-2016標(biāo)準(zhǔn)，采用Folin-Ciocalteu比色法，在750nm處測(cè)定沒食子酸當(dāng)量(GAE)。樣品經(jīng)70%乙醇超聲提取(功率200W，時(shí)間30min)后，與福林試劑和碳酸鈉溶液反應(yīng)2小時(shí)，檢測(cè)范圍0~200mg GAE/g。研究表明，茶多酚含量與ORAC值呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(r=0.89.p<0.01)。

類黃酮定量采用鋁鹽比色法，在510nm處測(cè)定槲皮素當(dāng)量(QE)。樣品經(jīng)甲醇-水(7:3)提取后，與亞xiao酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系反應(yīng)，pH值嚴(yán)格控制在5.0.該方法線性范圍0~100mg QE/g，回收率95%~105%。

抗氧化酶活性測(cè)定涵蓋超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱gan肽過氧化物酶(GPx)等內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)。其中SOD活性采用黃piao呤氧化酶法，在550nm處監(jiān)測(cè)氮藍(lán)四唑(NBT)光還原的抑制率，單位定義為抑制50%酶活所需的樣品量(U/mg)。

標(biāo)準(zhǔn)方法的選擇與結(jié)果判定

根據(jù)《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法(2023年版)》要求，抗氧化功能評(píng)價(jià)需至少采用兩種方法聯(lián)合驗(yàn)證。對(duì)于原料篩選，可優(yōu)先選擇ORAC法結(jié)合DPPH法;產(chǎn)品質(zhì)控則推薦FRAP法與脂質(zhì)過氧化抑制率測(cè)定的組合方案。人體試食試驗(yàn)需檢測(cè)血清丙二醛(MDA)含量下降率及超氧化物歧化酶(SOD)活力提升幅度，其中MDA下降≥15%且SOD提升≥20%為功能陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)方面，CNAS認(rèn)可要求實(shí)驗(yàn)室需通過AOAC 2012.04方法的驗(yàn)證，包括方法檢出限(LOD≤0.1μmol TE/g)、定量限(LOQ≤0.3μmol TE/g)及加標(biāo)回收率(80%~120%)等關(guān)鍵參數(shù)的驗(yàn)證。每批次樣品需帶陽性對(duì)照(Trolox標(biāo)準(zhǔn)品)和空白對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有效性。

抗氧化功能檢測(cè)已形成從實(shí)驗(yàn)室到臨床的完整證據(jù)鏈，未來隨著3D細(xì)胞模型和類器官技術(shù)的發(fā)展，將進(jìn)一步提升評(píng)價(jià)體系的生理相關(guān)性。對(duì)于企業(yè)而言，選擇通過CNAS認(rèn)證的檢測(cè)機(jī)構(gòu)，嚴(yán)格遵循GB 5009.268-2016等國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，是確保產(chǎn)品合規(guī)性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。